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Protein G琼脂糖纯化树脂用于纯化和分离IgG。Protein G是一种分离自G链球菌的细胞壁蛋白质，主要通过Fc片段与哺乳动物的IgG结合。天然Protein G含有3个IgG结合位点以及白蛋白和细胞表面结合的位点。重组的Protein G中去除了白蛋白和细胞表面结合域，减少了非特异性结合。另外为了增强其固定能力，设计了3个Cys标签到重组的Protein G的C末端。尽管Protein A和Protein G的三级结构非常相似，但是它们的氨基酸组成差异很大，因此具有不同的结合特征。Protein G能够用于纯化分离哺乳动物单克隆和多克隆IgG，它们不与Protein A结合。与Protein A相比，Protein G对大多数哺乳动物的IgG具有更强的亲和力，特别是对于某些亚类，如人的IgG3，小鼠的IgG1和大鼠的IgG2a。另外Protein G不与人的IgM、IgD和IgA结合。

• 有更广泛的与IgG种类结合能力及更强的亲和力；
  
• 不同于Protein A的特异性结合；
  
• 琼脂糖介质；
  
• 没有特异性的白蛋白结合；
  
• 优化的均质的重组配体；
  
• 载量更高。

• 结合/洗涤缓冲液(Binding/Wash Buffer)：0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH7.0～7.5。
  
• 洗脱缓冲液(Elution Buffer)：0.1M柠檬酸，pH3.0或0.1M甘氨酸，pH3.0。
  
• 中和液(Neutralizing Buffer)：1M Tris-HCl，pH8.5。

• 也可选购百奥莱博产品：结合/洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和中和液
  
• 所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

上柱前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用Binding/Wash Buffer对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用Binding/Wash Buffer透析。样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

• 重力柱装填：
  
  • 取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
    
  • 将蛋白G琼脂糖树脂混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(填料实际体积占悬液的一半)，打开下出口流干保护液。
    
  • 加入适量纯水冲洗填料，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
    
  • 装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
    
  • 装填好的重力柱可以直接加入结合/洗涤缓冲液进行平衡，暂不使用时则加入保护液(20%乙醇的1×PBS)，2～8℃保存。
• 中压层析柱的装填：
  蛋白G琼脂糖树脂被广泛应用于工业纯化，下面介绍使用蛋白G琼脂糖树脂填装层析柱的方法。
  装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需填料体积，公式如下：
  V=1.15πr²h(V：所需填料体积ml，1.15：填料压缩系数，r：柱管半径cm，h：装填高度cm)
  
  • 所取悬液体积应为填料体积的两倍，因为填料体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。
  层析柱的装填(使用储液器装填)：
  • 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1~2cm的去离子水。
    
  • 将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
    
  • 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
    
  • 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水，标上柱床高度。
    
  • 关闭泵，关闭层析柱出口。
    
  • 如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
    
  • 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
    
  • 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

• 孵育法纯化(GS4377/GS4805/GS4806适用)
  
  • 根据纯化的样品量，取适量蛋白G琼脂糖树脂加入离心管中，1000rpm离心1min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
    
  • 向离心管中加入5倍填料体积的Binding/Wash Buffer清洗填料进行平衡，1000rpm离心1min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干Binding/Wash Buffer；重复两次以上。
    
  • 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4℃振荡孵育2~4h或者37℃孵育30min～2h。
    
  • 孵育结束后，1000rpm离心1min，吸弃上清或过滤收集填料，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
    
  • 用5倍填料体积的Binding/Wash Buffer清洗填料进行洗杂，1000rpm离心1min或重力柱管过滤，去除上清(注意不要吸到填料)，重复3～5次，中间建议更换新离心管。
    
  • 加入3～5倍柱体积的Elution Buffer进行洗脱，室温孵育5min，1000rpm离心1min或重力柱管收集洗脱液，可重复2～3次。洗脱组分需要立即用Neutralizing Buffer调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的中和液进行中和。
• 重力柱法纯化(GS4805/GS4806适用)
  
  • 将装填好的重力柱用5倍柱体积Binding/Wash Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2～3次。
    
  • 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2min，保证样品和填料充分接触，收集流穿液，可以反复上样增加结合效率。
    
  • 用10～15倍柱体积的Binding/Wash Buffer进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
    
  • 使用5～10倍柱体积的Elution Buffer洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分需要立即用Neutralizing Buffer调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的中和液进行中和。
• 中压层析法纯化(GS4807适用)
  填料装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统，这里依照ÅKTA仪器使用为例介绍使用方法。
  
  • 将泵管道中注满去离子水。去掉上层塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
    
  • 用3～5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
    
  • 使用至少5倍柱床体积的Binding/Wash Buffer平衡色谱柱。
    
  • 利用泵或样品环上样。
    
    • 样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
  • 用Binding/Wash Buffer冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10～15个柱体积)。
    
  • 使用5～10倍柱体积的Elution Buffer洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。洗脱组分需要立即用Neutralizing Buffer调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的Neutralizer Buffer进行中和。

• 纯化后的填料处理方法
  上述步骤填料洗脱结束后，先用Binding/Wash Buffer冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用20%乙醇冲洗2个柱体积，然后将填料置于保护液(20%乙醇的1×PBS)于2～8℃保存，不可冻存。
  
• SDS-PAGE检测
  将使用纯化产品得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
  
• 填料清洗
  本蛋白G琼脂糖树脂可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对树脂进行清洗。
  
  • 去除一些沉淀或变性物质
    用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的1×PBS,pH7.4清洗。
    
  • 去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
    用3～4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的1×PBS,pH7.4清洗。

• 在进行IP实验前需确认蛋白表达情况并用抗体做探针识别诱饵蛋白和目的蛋白，如果诱饵蛋白通过WB没有检测到，那无需进行免疫沉淀实验，必须确认诱饵蛋白是否已经表达；
  
• 每份裂解液建议含有的大致相同数目的蛋白，此步可通过多次转染及尽可能修正使用的DNA数目、蛋白表达时间或细胞株来解决；
  
• 建议选择易于培养且有高转染效率的细胞。

• 取100μL的Protein G纯化树脂(50μL树脂体积+50μL的填料保护液)，加入2倍体积的1×PBS洗涤Protein G纯化树脂两次，再向Protein G纯化树脂中加入1倍体积的1×PBS缓冲溶液混合。建议在洗涤Protein G纯化树脂时切开移液器吸头，以免珠粒被刺破；
  
• 每100μL的Protein G纯化树脂(50μL树脂体积+50μL的1×PBS)中加入1mL细胞裂解液，4℃下在摇床或轨道振荡器上孵育10min，在后续的测试中裂解液能够减少蛋白质与树脂的非特异性结合；
  
• 4℃下以12000g离心10min去除Protein G纯化树脂，将上清液转移到干净的离心管中；
  
  • 步骤1~3为裂解液预清理，因部分内源物的低活性及蛋白印迹对目的蛋白检测的特异性，在一般情况下，预清理是可以省略的，但在第一次进行特异的免疫沉淀时，不建议省略此步。
• 确定细胞裂解物中蛋白质浓度(若用Bradford法测定浓度，测试前至少1∶10稀释细胞溶解物，因为裂解缓冲液中的洗涤剂对考马斯亮蓝会有干扰作用，请先确认好裂解液中相关组分对蛋白定量方法的影响)；
  
• 用1×PBS稀释细胞裂解物至约1μg/μL细胞蛋白的含量，以减少缓冲液中洗涤剂的浓度。而对于倾向于低浓度表达的免疫沉淀蛋白，可使用浓缩的细胞液(10μg/μL)。
  
• 每500μL细胞裂解液中加入相应稀释倍数后的捕获抗体(1μg～10μg)。定量免疫沉淀目标蛋白的最佳量必须对每个样本进行实证检验；
  
• 在摇床或轨道振荡器上，将细胞裂解物与抗体混合后的产物4℃下轻轻摇动2h或过夜；
  
  • 建议：在激酶和磷酸酶测定中免疫活化酶的孵育时间为2h。
• 再取100μL的已用1×PBS洗涤过的Protein G纯化树脂(50μL树脂体积+50μL的1×PBS)加入到细胞裂解物/抗体混合物中，4℃下在摇床或轨道振荡器上轻轻晃动1h或过夜来捕获免疫复合物(以保证填料始终处于混悬状态)；
  
• 4℃下以12000g离心收集树脂，此时树脂上已带有捕获抗体和相关的蛋白复合体，用移液枪小心吸取上清液并预留10～20μL上清液作为树脂保护液，多余上清液弃掉，用800μL预冷RIPA裂解液或1X PBS缓冲液洗涤球珠3次，清洗请通过轻弹或颠倒试管温和重选树脂填料，整个过程保持低温环境；
  
• 向树脂中加入60μL的2×Loading Buffer，轻轻混匀，能够允许足够的容量来运行三个泳道；
  
• 将树脂煮沸5min，使得免疫复合物与球珠分离，室温下14000g离心除去珠粒，转移上清液20μL进行SDS-PAGE分析；
  
  • 若样品冻融后再使用时必须再次进行煮沸后再进行SDS-PAGE电泳。